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BMC Medicine Band 21, Artikelnummer: 330 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das natürliche Killer-/T-Zell-Lymphom (NKTCL) ist ein aggressives Lymphom mit einer schlechten Prognose. Die Therapie mit chimären Antigenrezeptor-transduzierten T-Zellen (CAR-T) hat sich zu einer vielversprechenden immuntherapeutischen Strategie gegen hämatologische Malignome entwickelt.

In dieser Studie wurden vier CAR-T-Zelllinien (CD38-CAR, LMP1-CAR, CD38-LMP1 Tandem CAR 1 und CD38-LMP1 Tandem CAR 2) generiert. Die Wirkung von CAR-T-Zellen gegen NKTCL-Zellen wurde sowohl in vitro als auch in vivo bewertet. Die Expression von T-Zell-Aktivierungsmarkern und Zytokinen, die von CAR-T-Zellen produziert werden, wurde mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen.

Die vier CAR-T-Zelllinien könnten bösartige NKTCL-Zellen wirksam eliminieren. Sie könnten aktiviert werden und zielabhängig entzündliche Zytokine produzieren. In-vivo-Tests zeigten, dass die CAR-T-Zellen in einem xenotransplantierten NKTCL-Mausmodell signifikante Antitumorwirkungen zeigten.

Zusammenfassend zeigten vier CAR-T-Zelllinien sowohl in vitro als auch in vivo eine signifikante Zytotoxizität gegenüber NKTCL-Zellen. Diese Ergebnisse zeigten das wirksame therapeutische Versprechen von CD38- und LMP1-CAR-T-Zellen bei NKTCL.

Peer-Review-Berichte

NKTCL ist ein aggressives Lymphom im Zusammenhang mit einer Infektion mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV), das vorwiegend in Asien und Südamerika auftritt [1,2,3]. NKTCL betrifft hauptsächlich extranodale Lokalisationen und zeigt im Frühstadium lokalisierte Symptome wie Nasenverstopfung und Epistaxis. Diese Krankheit kann sich auf mehrere Stellen ausbreiten und allgemeine Symptome wie Fieber, Gewichtsverlust und sogar hämophagozytische Lymphohistiozytose verursachen [4,5,6,7]. Alle NKTCL-Typen haben das entscheidende Merkmal einer EBV-Infektion gemeinsam. Daher ist ein positives Ergebnis einer EBV-Infektion für die Diagnose von NKTCL unerlässlich [8]. Chemotherapie in Kombination mit Strahlentherapie ist die häufigste Therapie für NKTCL im begrenzten Stadium, mit einem 5-Jahres-Gesamtüberleben (OS) von 72–74 %. Für Patienten mit NKTCL im fortgeschrittenen Stadium ist die systemische Chemotherapie immer noch die primäre Behandlung. Das Dexamethason-, Methotrexat-, Ifosfamid-, L-Asparaginase- und Etoposid-Regime (SMILE) erzielte im Vergleich zum herkömmlichen Cyclophosphamid-, Hydroxydaunorubicin-, Oncovin- und Prednison-Regime (CHOP) ein verlängertes OS und ein progressionsfreies Überleben (PFS) [9]. Im Jahr 2011 wurde das neuartige Chemotherapie-Regime mit Dexamethason, Cisplatin, Gemcitabin und Pegaspargase (DDGP) entwickelt und zeigte vielversprechende Ergebnisse bei NKTCL-Patienten [10].

Die Immuntherapie für NKTCL hat sich langsam entwickelt. Studien haben gezeigt, dass Anti-CD30- und Anti-PD1-Antikörper wirksame Therapeutika für rezidiviertes/refraktäres NKTCL sein können [11]. Im letzten Jahrzehnt hat eine vielversprechende und spezifische Immuntherapie, die CAR-T-Zelltherapie, die Aufmerksamkeit von Onkologen auf sich gezogen. CAR ist eine Art synthetischer Rezeptor, der eine Antigen-erkennende Domäne mit T-Zell-Signaldomänen fusioniert. Mit einem CAR beladene T-Zellen können Zielmoleküle HLA-unabhängig erkennen [12, 13]. CAR-T-Zellen, die auf CD19 abzielen, sind derzeit die erfolgreichste CAR-T-Zelltherapie, die Wirksamkeit und immunologische Spezifität bei der Behandlung von Lymphomen gezeigt und bei der klinischen Verabreichung von B-Zell-Malignitäten eingesetzt wurde [12, 14].

CD38 ist an der Pathogenese und dem Ausgang einer Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus und chronischer lymphatischer Leukämie beteiligt [15]. Studien haben die Wirksamkeit von Behandlungen gezeigt, die auf CD38-Moleküle beim multiplen Myelom abzielen [16]. Das latente Membranprotein 1 (LMP1) wird von EBV kodiert. Es wurde gezeigt, dass LMP1 eine maligne Transformation in B-Zellen und Epithelzellen auslösen kann [17]. Diese Ergebnisse legen das klinische Potenzial von CD38- und LMP1-zielgerichteten Therapien bei CD38+- oder LMP1+-Malignitäten nahe.

In dieser Studie untersuchten wir zunächst die Machbarkeit einer CAR-T-Zelltherapie, die sowohl auf CD38 als auch auf LMP1 abzielt. Es wurden vier CAR-T-Zelllinien (CD38-CAR, LMP1-CAR, CD38-LMP1 Tandem CAR 1 und CD38-LMP1 Tandem CAR 2) konstruiert und ihre Antitumorwirkungen sowohl in vitro als auch in vivo bewertet.

Die in dieser Studie verwendeten Zelllinien NKYS, YT und KAI3 wurden von Dr. Wing C. Chan (City of Hope Medical Center, Los Angeles, USA) erhalten. Dr. Norio Shimizu und Yu Zhang von der Universität Chiba stellten SNK6-Zellen zur Verfügung. SNT16-Zellen waren ein Geschenk der Guangzhou Bairui Biomedical Technology Company, Ltd. NKYS-, YT-, KAI3- und SNT16-Zellen wurden in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS (Gibco, USA) und Antibiotika (100 U/ml Penicillin, 100 µg), kultiviert /ml Streptomycin). Dem Medium für NKYS- und KAI3-Zellen wurde zusätzliches IL-2 (100 IU/ml) zugesetzt. SNK6-Zellen wurden in RPMI-1640-Medium mit 10 % Immunzellserumersatz (Gibco, USA), IL-2 (200 IE/ml) und Antibiotika kultiviert. Alle Zellen wurden in einem Inkubator (Thermo Fisher, USA) bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Alle Zelllinien wurden negativ auf Mykoplasmenkontamination getestet und Zelloberflächenmarker für diese Zelllinien wurden durch Durchflusszytometrie validiert.

Die Zellen wurden in NP40-Lysepuffer lysiert und dann zentrifugiert, um den Proteinüberstand zu ernten. Zwanzig Mikrogramm Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf die Polyvinylidenfluoridmembranen (Amersham Biosciences, USA) übertragen. Die Membranen wurden in Tris-gepuffertem Salzlösungs-Tween-Puffer mit 5 % (Gew./Vol.) fettfreier Milch bei Raumtemperatur 1 Stunde lang blockiert und dann mit Primärantikörpern einschließlich Anti-LMP1 (Abcam, ab78113) und Anti-GAPDH (ProteinTech) inkubiert , 60.004–1-lg) bei 4 °C über Nacht und dann mit sekundären Antikörpern für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Bandbilder wurden mit einem ChemiDocTM XRC+-System (Bio-Rad Laboratories, USA) digital erfasst.

NKYS-, YT-, KAI3-, SNK6- und SNT16-Zellen wurden in Formalin fixiert und in Phosphatpufferlösung (PBS) mit 5 % Ziegenserum und 0,1 % Triton X-100 blockiert. Anschließend wurden die Zellen über Nacht bei 4 °C mit einem Anti-LMP1-Antikörper (Abcam, ab78113) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit einem Cy3-markierten Ziege-Anti-Maus-Sekundärantikörper und DAPI inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon, Japan) bei 40-facher Vergrößerung analysiert.

Tumorgewebe von NKTCL-Patienten oder tumortragenden Mäusen wurden in Formalin fixiert, entkalkt und in Paraffin eingebettet. Nach der Antigengewinnung wurden die Schnitte mit 0,3 % H2O2 in Methanol blockiert. Die Schnitte wurden 10 Minuten lang in Citratpuffer gekocht und mit serumfreiem Proteinblock blockiert. Anschließend wurden die Objektträger mit Primärantikörpern gegen CD38 (Servicebio, GB114831), LMP1 (Abcam, ab78113), CD3ε (Servicebio, GB13014) oder CD56 (Servicebio, GB12041) und Meerrettichperoxidase (HRP) inkubiert. markierter Sekundärantikörper. Für die In-situ-Hybridisierung mit EBV-kodierter RNA (EBER) wurden die Schnitte mit Magenenzymen behandelt und nach dem Entparaffinieren mit Alkohol dehydriert. Anschließend wurden die Schnitte mit EBER-Sonde und HRP-markiertem Anti-Digoxin-Antikörper inkubiert. Nach der Inkubation mit HRP-markierten Antikörpern wurden die Schnitte dreimal mit PBS gewaschen und mit DAB-Farbentwicklungslösung gefärbt. Anschließend wurden die Schnitte mit Hämatoxylin gegengefärbt, durch eine abgestufte Alkoholreihe dehydriert, in Xylol geklärt und mit Deckgläsern abgedeckt. Der Prozentsatz positiver Zellen wurde wie folgt bewertet: 0, negative Expression (die Häufigkeit positiver Zellen betrug weniger als 5 %); 1, schwach positiver Ausdruck (die Häufigkeit positiver Zellen betrug 5 % ~ <25 %); 2, positiver Ausdruck (die Häufigkeit positiver Zellen lag zwischen 25 und < 50 %); und 3, stark positive Expression (die Häufigkeit positiver Zellen betrug ≥ 50 %).

Die CAR-Sequenzen umfassten die Domäne(n) des Genfragments der variablen Region des Einzelkettenantikörpers (scFv) von CD38- und/oder LMP1-spezifischen Antikörpern, eine CD8a-Transmembrandomäne, eine kostimulatorische 4-1BB-Domäne und ein CD3ζ-Motiv. Die CAR-Sequenzen wurden synthetisch hergestellt (GENEWIZ, Suzhou, China) und in den pEF-MCS-P2A-EGFP-Vektor kloniert. Unter diesen wurde die LMP1-CAR-Sequenz mit oder ohne EGFP kloniert und fusioniert. CD38-CAR- und zwei Tan-CAR-Sequenzen wurden nicht mit EGFP fusioniert.

293 T-Zellen wurden in DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und Antibiotika, kultiviert. Anschließend wurden pRSV-Rev-, pLP-VSVG-, pCMV-Gag-Pol-Vektoren und CAR-Konstrukte (oder Vektor) unter Verwendung von PEI-Transfektionsreagenz (Sigma, USA) in 293 T-Zellen transfiziert. 72 Stunden nach der Transfektion wurden zellfreie Überstände gesammelt und unter Verwendung eines Ultrafiltrationsgeräts (Merck Millipore, USA) konzentriert.

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) wurden durch Ficoll-Paque-Dichtezentrifugation aus dem peripheren Blut gesunder Spender isoliert. Anschließend wurden T-Zellen mithilfe magnetischer Zelltrennung (MACS) und CD3-Dynabeads (Miltenyi Biotec, Deutschland) aus PBMCs isoliert und in X VIVO-15-Medium (LONZA, Schweiz), ergänzt mit 200 IE/ml IL-2 und CD3/28, kultiviert Dynabeads (Gibco, USA).

T-Zellen wurden durch Inkubation mit einem CAR-Lentivirus (CAR-T) oder Vektor-Lentivirus (Kontroll-T) transduziert. Nach sofortiger Zentrifugation für 90 Minuten bei 37 °C wurden die transduzierten Zellen 48 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Der LMP1-CAR-EGFP-Fusionsvektor wurde zum Nachweis der Transfektionseffizienz und zum In-vitro-Zytotoxizitätstest verwendet. Der LMP1-CAR-Vektor ohne EGFP wurde zum Nachweis von T-Zell-Aktivierungsmarkern, zur Zytokinproduktion und für In-vivo-Experimente verwendet. Die Transfektionseffizienz von CD38-CAR oder zwei Tan CAR-T-Zellen wurde durch einen fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) unter Verwendung von Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markiertem rekombinanten menschlichen CD38-Protein (ACROBiosystems, China) nachgewiesen.

Reihenverdünnungen von CAR-T- oder Kontroll-T-Zellen (Effektor) wurden mit NKTCL-Zelllinien (Ziel) bei E:T-Verhältnissen (Effektor-zu-Ziel) von 4:1, 2:1, 1:1 und 1 co-inkubiert :2 für 6 Stunden. Die Zytotoxizität von CAR-T-Zellen wurde durch Messung der Laktatdehydrogenase (LDH)-Freisetzung durch geschädigte Tumorzellen bestimmt. LDH im Überstand wurde mit einem CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit (Promega, USA) nachgewiesen.

Um die Zytotoxizität von T-Zellen bei einem niedrigeren E:T-Verhältnis zu bewerten, wurden NKTCL-Zelllinien mit Carboxyfluoresceindiacetat und Succinimidylester (CFSE) markiert und dann mit CAR-T oder Kontroll-T-Zellen bei einem E:T-Verhältnis von 1 co-inkubiert :2 für 18 Stunden. Anschließend wurden die Zellen mit Annexin V und PI (Keygen Biotech, Jiangsu, China) gefärbt und auf einem FACSCalibur-Durchflusszytometer analysiert.

CAR-T-Zellen oder Kontroll-T-Zellen wurden mit NKTCL-Zelllinien (Behandlungsgruppe) im Verhältnis 1:10 oder mit Medium (Leergruppe) 24 Stunden lang inkubiert, bevor Aktivierungsbiomarker von T-Zellen nachgewiesen wurden. Anschließend wurden verschiedene Untergruppen von T-Zellen mithilfe von Fluorescein-konjugierten Antikörpern identifiziert, die für menschliches CD4, CD8, CD25, CD69, CD38 und HLA-DR (BD Bioscience, USA) spezifisch sind.

Ein zytometrisches Bead-Array (CBA) wurde verwendet, um die entzündlichen Zytokine und Granzym B im Zellüberstand nachzuweisen. Kurz gesagt, 2 × 104 CAR-T- oder Kontroll-T-Zellen wurden mit 2 × 105 NKTCL-Zielzellen (Behandlungsgruppe) oder Medium (Leergruppe) in einem 200-μl-Volumen für 24 Stunden co-kultiviert. Anschließend wurden 50 μl Zellüberstand oder Zytokin-Standardverdünnungen mit unterschiedlichen Konzentrationen mit spezifischen Einfangkügelchen inkubiert, die IL-2, IL-5, IL-6, IL-13 und den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) erkennen. Granzym B, Interferon (IFN)-γ und Tumornekrosefaktor (TNF)-α sowie Phycoerythrin (PE)-markierte Nachweisantikörper (BD Bioscience, USA) für 2 Stunden. Die Perlen wurden gewaschen und die Fluoreszenzintensität der Einfangperlen wurde durch einen standardisierten Durchflusszytometrie-Assay analysiert. Die Standardkurve wurde anhand der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität der Standardverdünnungen berechnet. Anschließend wurde die Konzentration der Zytokine im Zellüberstand anhand der Standardkurve berechnet.

Die in dieser Studie verwendeten NSG-Mäuse (3–4 Wochen alt, weiblich, 15–20 g) wurden vom Shanghai Model Organisms Center (Shanghai, China) bezogen. Insgesamt 5 × 106 NKYS-Luciferase-Zellen wurden mit isopyknischem Matrigel (Corning Incorporated, USA) gemischt und Mäusen subkutan implantiert. Die Mäuse in den Behandlungsgruppen (n = 6 pro Gruppe) erhielten an den Tagen 15 und 18 nach der Tumorimplantation eine intravenöse Injektion von 4 CAR-T-Zellen oder Kontroll-T-Zellen in die Schwanzvene, wobei pro Maus insgesamt 1 × 107 T-Zellen infundiert wurden ( ca. 4 × 106 transduzierte Zellen). Mäuse in der Blindgruppe wurden nicht behandelt. Die Tumorgröße wurde in den ersten 50 Tagen nach der Implantation alle 3 Tage und nach 50 Tagen täglich mit einem Messschieber gemessen. Den Mäusen wurde D-Luciferin (150 mg/kg, ip) verabreicht und sie wurden mit Isofluran betäubt. Nach 5 Minuten wurde die Lumineszenz mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) nachgewiesen und die Intensität mit der Living Image-Software (PerkinElmer, MA, USA) quantifiziert und normalisiert. Als Endereignis galt eine Tumorgröße von 1000 mm3 oder der Tod einer Maus. Nach 75 Tagen wurden die Mäuse durch Genickbruch eingeschläfert.

Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism Version 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung oder Median und Interquartilbereich für wiederholte Messungen angegeben. Zur Beurteilung der Unterschiede zwischen normalverteilten Stichproben wurde eine Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließendem Bonferroni-Post-Test durchgeführt. Für nicht normalverteilte Stichproben wurde der Mann-Whitney-Test verwendet. Ein Wert von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die Expression von CD38 und LMP1 in Tumorgeweben von 10 NKTCL-Patienten wurde bewertet (Abb. 1a, Zusatzdatei 1: Abb. S1). Insgesamt waren 7/10 Patienten positiv für CD38 (Score über 1) und 5/10 Patienten waren positiv für LMP1 (Score über 1) (Tabelle 1).

CD38- und LMP1-Expression bei NKTCL-Patienten und Zelllinien. eine CD38- und LMP1-Expression bei NKTCL-Patienten. Pfeile zeigten die positiven Zellen. Maßstabsbalken: 10 μm. b CD38-Expression in NKTCL-Zelllinien, nachgewiesen durch FACS. c LMP1-Expression in NKTCL-Zelllinien, nachgewiesen durch Immunfluoreszenz. Rote Fluoreszenz zeigte die positiven Zellen. d LMP1-Expression in NKTCL-Zelllinien, nachgewiesen durch Western Blot. e Fragmentsequenzen von vier CARs und Konstrukte von zwei Tan CARs

Als Zielzellen wurden in dieser Studie die NKTCL-Zelllinien NKYS, YT, KAI3, SNK6 und SNT16 verwendet. Der FACS-Nachweis zeigte eine homogene Expression von CD38 auf NKYS-, YT- und KAI3-Zellen und eine negative Expression auf SNK6- und SNT16-Zellen (Abb. 1b). Immunfluoreszenz- und Western-Blot-Analysen zeigten eine positive Expression von LMP1 in NKYS-, KAI3- und SNK6-Zellen (Abb. 1c, d). Die 5 Zielzelllinien konnten in vier Gruppen eingeteilt werden: CD38 + LMP1 + -Zellen (NKYS und KAI3), CD38 + LMP1 – -Zellen (YT), LMP1 + CD38 – -Zellen (SNK6) und CD38-LMP1 – -Zellen (SNT16).

Die Anti-CD38- und Anti-LMP1-scFv-Sequenzen basierten auf veröffentlichten CD38- und LMP1-spezifischen Antikörpersequenzen [18, 19]. Zwei einzeln zielgerichtete CARs (CD38-CAR und LMP1-CAR) enthielten die entsprechende scFv-Domäne, während zwei Tandem-CARs (Tan CAR 1 und Tan CAR 2) beide scFv-Domänen in unterschiedlicher Reihenfolge enthielten, die über einen G4S-Linker verbunden waren (Abb. 1e). . Das CD38-CAR oder zwei Tan CAR-T-Zellen konnten durch rekombinantes menschliches CD38-Protein markiert und durch FACS nachgewiesen werden, was auf die Bindungsaffinität von CAR-T-Zellen zum CD38-Protein schließen lässt. Die Affinität von LMP1-CAR- und zwei Tan CAR-T-Zellen zum LMP1-Protein wurde durch ihre unterschiedlichen Wirkungen auf LMP1 + - oder LMP1 − -Tumorzellen in nachfolgenden In-vitro- und In-vivo-Experimenten gezeigt (Zusatzdatei 1: Abb. S2).

Von lysierten Tumorzellen freigesetztes LDH wurde nachgewiesen, um die Zytotoxizität von CAR-T-Zellen zu bewerten. Im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen zeigten CD38-CAR- und LMP1-CAR-T-Zellen eine signifikant höhere Zytotoxizität gegenüber CD38+-Zielzellen (NKYS, YT und KAI3) bzw. LMP1+-Zielzellen (NKYS, KAI3 und SNK6) bei einem E :T-Verhältnis von 4:1. Es gab jedoch keinen Unterschied bei CD38 − (SNK6 und SNT16) oder LMP1 − (YT und SNT16) Zellen. Tan CAR 1- und Tan CAR 2-T-Zellen lysierten sowohl CD38+- als auch LMP1+-Zielzellen (NKYS, YT, KAI3 und SNK6) effizient. Sie zeigten jedoch keine offensichtliche Zytotoxizität gegenüber CD38-LMP1 − -Zellen (SNT16). Die Reaktion der Kontroll-T-Zellen auf alle NKTCL-Zielzellen war begrenzt. Wir analysierten auch die zytolytische Aktivität von Single-Targeted- und Tan-CAR-T-Zellen. Die beiden Tan-CAR-T-Zellen zeigten eine signifikant höhere Zytotoxizität gegenüber CD38 + LMP1 + -Zellen (NKYS und KAI3) als CD38-CAR- und LMP1-CAR-T-Zellen (Abb. 2a).

Zytotoxizität von CAR-T-Zellen. a CAR-T- oder Kontroll-T-Zellen wurden 6 Stunden lang mit NKTCL-Zelllinien koinkubiert. Die zytotoxische Wirkung von CD38-CAR-T und Kontroll-T-Zellen wurde durch den Nachweis von LDH bewertet, das von Tumorzellen freigesetzt wurde. b CAR-T- oder Kontroll-T-Zellen wurden 18 Stunden lang mit CFSE-markierten NKTCL-Zelllinien koinkubiert. Die Zellen wurden mit Annexin V und PI gefärbt, um die Zytotoxizität von T-Zellen zu bewerten. Ein Wert von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. ns, nicht signifikant; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001

Zur Bestimmung der Antitumorwirkung bei einem niedrigeren E:T-Verhältnis wurden CAR-T-Zellen 18 Stunden lang mit mit CFSE markierten NKTCL-Zelllinien koinkubiert. Bei einem E:T-Verhältnis von 1:2 zeigten CAR-T-Zellen eine signifikante Zytotoxizität gegenüber zielpositiven NKTCL-Zellen (Abb. 2b, c). Ähnlich wie bei früheren Ergebnissen zeigten die 2 Tan-CAR-T-Zellen eine signifikant höhere Zytotoxizität gegenüber CD38 + LMP1 + -Zellen als 2 einzeln zielgerichtete CAR-T-Zellen (Abb. 2b, c).

Die Stimulation von T-Zellen kann zu einer Hochregulierung von Oberflächenzellaktivierungsmarkern führen, einschließlich früher (CD69) und später (CD25 und HLA-DR) Aktivierungsmarker [20]. Um die zielabhängige Aktivierung von T-Zellen zu bewerten, wurden Kontroll-T- und CAR-T-Zellen 24 Stunden lang mit allen 5 NKTCL-Zielzelllinien kokultiviert. Die Daten zeigten, dass die gemeinsame Inkubation mit zielpositiven NKTCL-Zellen die Expression von CD25 und HLA-DR sowohl in der CD4+- als auch in der CD8+-Untergruppe von CAR-T-Zellen signifikant erhöhen könnte (Abb. 3a, b, Zusatzdatei 1: Abb . S3-S4).

Aktivierung und Zytokinfreisetzung von mit NKYS kokultivierten CAR-T-Zellen. a Die Expression von Aktivierungsmarkern (CD69, CD25 und HLA-DR) auf CD4+- und CD8+-Untergruppen von T-Zellen wurde durch FACS nachgewiesen. b Statistische Ergebnisse der Expression von Aktivierungsmarkern auf T-Zellen. ΔProzentsatz entspricht der Differenz zwischen dem Anteil der positiven Subpopulation von T-Zellen in der Behandlungsgruppe und der Blindgruppe. c Von CAR-T-Zellen und Kontroll-T-Zellen freigesetzte Zytokine wurden mit dem CBA-Kit nachgewiesen. Δpg/ml bezieht sich auf den Unterschied zwischen der Zytokinkonzentration in der Behandlungs- und Blindgruppe. Ein Wert von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. ns, nicht signifikant; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001

Es wurden entzündliche Zytokine und von T-Zellen freigesetztes Granzym B nachgewiesen. Nach 24-stündiger Co-Kultivierung der 4 CAR-T-Zellen oder Kontroll-T-Zellen mit NKTCL-Zielzellen wurde der Zellüberstand geerntet und die Konzentrationen von IL-2, IL-5, IL-6, IL-13, GM- CSF, Granzym B, IFN-γ und TNF-α wurden mittels Durchflusszytometrie gemessen. Die Daten zeigten, dass die 4 CAR-T-Zelllinien, die durch zielpositive NKTCL-Zellen stimuliert wurden, im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen signifikant erhöhte Spiegel dieser Zytokine erzeugten (Abb. 3c, Zusatzdatei 1: Abb. S5-S6). Bei gemeinsamer Kultivierung mit CD38 + LMP1 + NKYS-Zellen produzierten die beiden Tan CAR-T-Zelllinien mehr IL-5, IL-6, IL-13, Granzym B, IFN-γ und TNF-α als LMP1-CAR-T Zellen. Ähnliche Ergebnisse wurden auch für die andere CD38 + LMP1 + -Zelllinie, KAI3, beobachtet.

Die In-vitro-Studien zeigten, dass die 4 CAR-T-Zelllinien im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen gültige Antitumorwirkungen zeigten. Daher untersuchten wir die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen gegen NKTCL-Zellen in vivo in einem subkutanen NKYS-Tumor-Xenotransplantat-NSG-Mausmodell weiter. Die Tumorlast wurde durch Messung der Lumineszenzintensität mittels IVIS überwacht. Zwölf Tage nach der Tumorzellimplantation wurden Mäuse mit einer intravenösen Injektion von Kontroll-T- oder CAR-T-Zellen behandelt (Abb. 4a). In der unbehandelten Gruppe und der mit T-Zellen behandelten Kontrollgruppe zeigten die Tumoren ein schnelles Fortschreiten (Abb. 4b). Die Behandlung mit CAR-T-Zellen induzierte eine signifikante Antitumorwirkung (Abb. 4c). Die Daten zeigten auch eine geringere Tumorbelastung in den beiden Gruppen von Mäusen, die mit Tan-CAR-T-Zellen behandelt wurden, im Vergleich zu denen, die mit Einzelziel-CAR-T-Zellen behandelt wurden, es gab jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen zwei mit Tan-CAR-T-Zellen behandelten Gruppen (Abb . 4d). Die CAR-T-Zelltherapie führte zu einem signifikanten Überlebensvorteil im Vergleich zur Blind- und Kontrollgruppe (Zusatzdatei 1: Abb. S7). Aus Mäusen isolierte Tumoren wurden mittels Immunhistochemie positiv auf CD3ε, CD56 und EBER gefärbt (Abb. 4e).

Wirksamkeit von CAR-T-Zellen auf NKTCL in vivo. a Überblick über die Behandlung des Xenotransplantat-Tumormodells in vivo. b, c Das Tumorwachstum wurde durch IVIS-Lebendbildgebung überwacht. Die Tumorlast der Maus wurde durch Biolumineszenzstrahlung angezeigt. d Tan CAR-T-Zellen zeigten im Vergleich zu CD38- oder LMP1-CAR-T-Zellen eine signifikante Antitumorwirkung. Das IHC zeigte, dass aus Mäusen isolierte Tumoren positiv für CD3ε, CD56 und EBER waren. Pfeile zeigten die positiven Zellen. Maßstabsbalken: 10 μm. Ein Wert von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. ns, nicht signifikant; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001

Im letzten Jahrzehnt hat die CAR-T-Zelltherapie ein enormes Potenzial bei der Behandlung von B-Zell-Leukämie und Lymphomen gezeigt [21, 22]. Unsere vorherige Studie hat gezeigt, dass die Verabreichung von CAR-T-Zellen eine vielversprechende immuntherapeutische Strategie für T-lymphoblastische Leukämie/Lymphom ist [23]. Bisher gibt es nur begrenzte Studien zur CAR-T-Zelltherapie bei NKTCL. CAR-T-Zellen, die auf CD38 und B7-H3 abzielen, wurden als zwei Immuntherapeutika für die NKTCL-Therapie bewertet [24, 25].

CD38 ist ein Typ-II-Transmembranglykoprotein, das in einer Vielzahl von Immunzellen exprimiert wird, darunter T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, Makrophagen und dendritische Zellen [26]. CD38 wurde als vielversprechendes Ziel für die Behandlung von Malignomen entwickelt. Eine klinische Studie (NCT02927925) zeigte, dass Daratumumab, ein monoklonaler Anti-CD38-Antikörper, eine Gesamtansprechrate (ORR) von 25,0 % bei der Behandlung von rezidiviertem oder refraktärem NKTCL erreichte [27]. Forscher haben auch die Durchführbarkeit einer CD38-CAR-T-Zelltherapie bei verschiedenen lymphatischen Neoplasien, einschließlich multiplem Myelom und NKTCL, bewertet [18, 21, 25].

EBV wird in fast allen NKTCL-Tumorzellen beobachtet [28]. LMP1 ist ein integrales Transmembranprotein, das von EBV kodiert wird und möglicherweise mit einer erhöhten malignen Neoplasie und einer Abnahme der Immunantwort verbunden ist [29]. LMP1 kann eine maligne Transformation in B-Zellen und Epithelzellen induzieren, indem es Zelloberflächenadhäsionsmoleküle induziert, Antigene aktiviert und antiapoptotische Proteine ​​hochreguliert [17, 30, 31, 32].

In dieser Studie haben wir die Expression von CD38 und LMP1 bei NKTCL-Patienten untersucht. Die Daten zeigten, dass CD38 in NKTCL-Tumorgeweben stark exprimiert wurde (7/10 positiv). Obwohl LMP1 nur bei 5/10 NKTCL-Patienten positiv war, ist es aufgrund seiner Rolle bei der malignen Transformation und der Immunantwort ein nicht zu vernachlässigendes Molekül. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Proteine ​​potenzielle Ziele für die Immuntherapie bei NKTCL sein könnten. Wir haben zwei Einzelziel-CARs konstruiert, CD38-CAR und LMP1-CAR. Beide CAR-T-Zelllinien könnten aktiviert werden und erhöhte Mengen an Zytokinen freisetzen, wenn sie mit CD38- oder LMP1-positiven NKTCL-Zellen inkubiert werden. Bei gemeinsamer Kultivierung mit NKTCL-Zelllinien zeigten CAR-T-Zellen eine erhöhte Expression von Markern für die Aktivierung später T-Zellen (CD25 und HLA-DR) sowohl in der CD4+- als auch in der CD8+-Untergruppe. Bei Aktivierung durch Zielantigene können CAR-T-Zellen Zytokine freisetzen und Tumorzellen lysieren [33]. In unserer Studie erzeugten durch NKTCL-Zellen stimulierte CAR-T-Zellen relativ hohe Mengen an IL-2, IL-5, IL-6, IL-13, GM-CSF, Granzym B, IFN-γ und TNF-α. Die größten Veränderungen zeigten die Produktion von IL-2, IL-6 und IFN-γ. IL-2 fördert die Proliferation von Immunozyten und die Transkription antiapoptotischer Proteine ​​[34]. IFN-γ ist an antiproliferativen, antiangiogenen und proapoptotischen Wirkungen gegen bösartige Zellen beteiligt [35]. IL-6 ist an chronischen Autoimmunentzündungen beteiligt und kann einen Zytokinsturm auslösen. Es wurde festgestellt, dass die Behandlung mit Tocilizumab, einem Anti-IL-6-Rezeptor-Antikörper, den durch die Therapie mit chimären Antigenrezeptoren (CAR)-T-Zellen verursachten Zytokinsturm lindert [36].

Unsere Daten zeigten auch eine signifikante zytolytische Aktivität von CD38 − und LMP1-CAR-T-Zellen gegen NKTCL-Zellen sowohl in vitro als auch in vivo. Im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen zeigten CAR-T-Zellen eine deutlich höhere Zytotoxizität gegenüber NKTCL-Zelllinien. Der LDH-Assay und der Annexin V-Assay zeigten, dass die beiden einzeln anvisierten CAR-T-Zellen CD38 + - oder LMP1 + NKTCL-Zellen schnell und effizient eliminieren konnten. Sie zeigten jedoch keine Wirkung auf CD38 – oder LMP1 – Zelllinien. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CAR-T-Zellen die entsprechenden Zielmoleküle erkennen und Tumorzellen HLA-abhängig eliminieren können. Die In-vitro-Zytotoxizität von CAR-T-Zellen wurde durch die mit dem In-vivo-Mausmodell erzielten Ergebnisse gestützt. Bei Mäusen, denen keine CAR-T-Zellbehandlung oder keine Kontroll-T-Zellinfusion verabreicht wurde, schritten die Tumoren schnell voran. Die Behandlung mit CAR-T-Zellen hemmte das Tumorwachstum deutlich.

Aufgrund der variablen Antigenheterogenität in Tumorzellen sind CAR-T-Zelltherapien, die auf mehr als ein Antigen abzielen, für Forscher von Interesse. Ein Tan CAR umfasst zwei Antigen-bindende Domänen in einer einzigen CAR-Struktur. Tan CAR-T-Zellen sind in der Lage, Zielzellen bei Verlust eines der Zielmoleküle zu lysieren und einen synergistischen Verstärkungseffekt zu erzeugen, indem sie beide Ziele erkennen [37, 38]. Tumoren, die aufgrund von Antigen-Austritt rezidiviert sind oder refraktär geworden sind, gehören zu den häufigsten Herausforderungen bei der gezielten Therapie. Eine Therapie mit Tan-CAR-T-Zellen, die für zwei unterschiedliche Ziele spezifisch sind, könnte ein praktikabler Ansatz sein, um das Antigen-Fluchtverhalten zu überwinden und die Spezifität von CAR-T-Zellen zu erweitern. Das Vorhandensein von scFvs gegen zwei Zielantigene könnte die T-Zell-Aktivierung und Zytolyse durch eine erhöhte Avidität verstärken [37]. Bisher wurden mehrere Tan-CAR-T-Zellen präklinisch gegen bösartige Zelllinien wie CD19-CD20, CD38-BCMA und CD70-B7-H3 Tan-CAR-T-Zellen getestet [38,39,40].

Wir haben zwei Tan CARs gebaut. Beide Tan CAR-T-Zelllinien konnten durch CD38- und/oder LMP1-positive NKTCL-Zellen aktiviert werden. Eine erhöhte Zytokinfreisetzung zeigte auch die zielabhängige Aktivierung der Tan CAR-T-Zellen. Nach der Stimulation mit CD38 + LMP1 + -Zellen (NKYS und KAI3) produzierten die beiden Tan CAR-T-Zelllinien mehr IL-13, Granzym B, IFN-γ und TNF-α als LMP1-CAR-T-Zellen, was darauf hindeutet, dass die Die Zytokinproduktion von Tan CAR-T-Zellen wurde hauptsächlich durch die Erkennung von CD38 beeinflusst. Sie zeigten sowohl in vitro als auch in vivo eine stärkere zytolytische Aktivität gegen Tumorzellen als einzelne CAR-T-Zellen. Im Vergleich zu den beiden Einzelziel-CAR-T-Zelllinien erzeugten die beiden Tan-CAR-T-Zelllinien ähnliche Wirkungen gegen YT-Zellen (CD38 + LMP1 −) und SNK6-Zellen (CD38-LMP1 +). Diese Ergebnisse bestätigten, dass Tan CARs einen synergistischen Verstärkungseffekt durch die Erkennung beider Ziele und die zytolytische Aktivität gegenüber NKTCL-Zellen bei Verlust eines der Zielmoleküle erzeugen.

In dieser Studie wurden erstmals sowohl CD38 als auch LMP1 als immuntherapeutische Ziele bei NKTCL verwendet. Alle vier CAR-T-Zelllinien zeigten in vitro und in vivo Zytotoxizität gegenüber NKTCL-Zellen. Diese CAR-T-Zellen könnten eine vielversprechende und wirksame Lösung für die Behandlung von Lymphomen darstellen. Insbesondere können die beiden Tan CARs die Herausforderung des Antigen-Austritts während der Immuntherapie vermeiden. Sie könnten in Zukunft eine vielversprechende und wirksame Lösung für die Behandlung von NKTCL darstellen.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

Varianzanalyse

Chimäres Antigenrezeptor-transduziertes T

Zytometrisches Perlenarray

Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester

Cyclophosphamid, Hydroxydaunorubicin, Oncovin und Prednison

Dexamethason, Cisplatin, Gemcitabin und Pegaspargase

EBV-kodierte RNA

Epstein Barr Virus

Fluoreszenzaktivierter Zellsortierer

Fluoresceinisothiocyanat

Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor

Meerrettich-Peroxidase

Interferon

In-vivo-Bildgebungssystem

Laktatdehydrogenase

Latentes Membranprotein 1

Magnetische Zelltrennung

Natürliches Killer-/T-Zell-Lymphom

Gesamtrücklaufquote

Gesamtüberleben

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes

Phosphatpufferlösung

Phycoerythrin

Progressionsfreies Überleben

Genfragment der variablen Region eines Einzelketten-Antikörpers

Dexamethason, Methotrexat, Ifosfamid, L-Asparaginase und Etoposid

Tumornekrosefaktor

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Unzutreffend.

Diese Arbeit wurde durch die Mittel für kreative Forschungsgruppen des First Affiliated Hospital der Zhengzhou University (QNCXTD2023012) und der National Natural Science Foundation of China (82000133; 81970184; 82170183; 82070209) sowie durch den Key Scientific Research Project Plan von Hochschulen und Universitäten in China unterstützt Provinz Henan (21A320027).

Hongwen Li und Wenting Song haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Abteilung für Onkologie, Jianshendong Rd., Das erste angegliederte Krankenhaus der Zhengzhou-Universität, Nr. 1, Zhengzhou, 450052, Provinz Henan, China

Hongwen Li, Wenting Song, Jiazhuo Wu, Zhuangzhuang Shi, Yuyang Gao, Jiwei Li, Lijuan Han, Jianxiang Zhang, Zhaoming Li und Mingzhi Zhang

Staatliches Schlüssellabor für die Prävention und Behandlung von Speiseröhrenkrebs und Henan-Schlüssellabor für Speiseröhrenkrebsforschung, das erste angegliederte Krankenhaus der Zhengzhou-Universität, Zhengzhou, Henan, China

Hongwen Li, Wenting Song, Jiazhuo Wu, Zhuangzhuang Shi, Yuyang Gao, Jiwei Li, Zhaoming Li und Mingzhi Zhang

Akademie der Medizinischen Wissenschaften der Zhengzhou-Universität, Zhengzhou, Henan, China

Wenting Song, Jiazhuo Wu, Zhuangzhuang Shi & Yuyang Gao

Medizinische Fakultät, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA

Yong Li

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HL gestaltete Forschung. HL, WS, JW, ZS, YG, JL und LH führten die Recherche durch und analysierten die Daten. HL, WS, JW, ZS, YG, JL und LH analysierten die Daten. HL hat den ersten Entwurf des Artikels geschrieben. JZ, ZL, YL und MZ haben den Artikel verbessert und überarbeitet. MZ hat den Artikel konzipiert. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Mingzhi Zhang.

Die Tierstudie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des First Affiliated Hospital der Zhengzhou University genehmigt (Lot-Nr. 2021-KY-00586). Die Studie mit menschlichen Teilnehmern wurde vom Institutional Research Ethics Committee des First Affiliated Hospital der Zhengzhou University genehmigt (Lot-Nr. 2021-KY-00586). In Übereinstimmung mit den in der Deklaration von Helsinki dargelegten Grundsätzen wurde für diese Studie eine schriftliche Einverständniserklärung von Patienten und gesunden Spendern eingeholt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

A: CD38- und LMP1-Expression bei NKTCL-Patienten. Abb. S2. Die CAR-Expression wurde durch FITC-markiertes menschliches CD38-Protein oder EGFP nachgewiesen. Abb. S3. Expression von Aktivierungsmarkern (CD69, CD25 und HLA-DR) auf CD4+- und CD8+-Untergruppen von CAR-T-Zellen, die mit YT, KAI3, SNK6 oder SNT16 kokultiviert wurden. Abb. S4. Statistische Ergebnisse der Expression von Aktivierungsmarkern auf CAR-T-Zellen, die mit YT, KAI3, SNK6 oder SNT16 kokultiviert wurden. Abb. S5. Statistische Ergebnisse der Zytokinfreisetzung von CAR-T-Zellen, die zusammen mit YT, KAI3, SNK6 oder SNT16 kultiviert wurden. Abb. S6. Das Flusshistogramm zeigte die Fluoreszenzintensität jedes Zytokins. Abb. S7. Überlebenskurvendaten für jede Versuchsgruppe.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Li, H., Song, W., Wu, J. et al. CAR-T-Zellen, die auf CD38 und LMP1 abzielen, zeigen eine starke Antitumoraktivität gegen NK/T-Zell-Lymphom. BMC Med 21, 330 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-03040-0

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Eingegangen: 14. April 2023

Angenommen: 18. August 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-03040-0

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